Résumé des travaux de PUSHPAMALI de SILVA : « BACH2 et immunosenescence 2019 »
INTRODUCTION
Le vieillissement est caractérisé par un déclin progressif de la surveillance immunitaire qui favorise le développement de la tumeur chez les patients âgés. L'un des mécanismes utilisé par les cellules malignes pour échapper à la surveillance immunitaire est la modification génétique ou épigénétique des gènes suppresseurs de tumeur. Des études sur les cellules B et nos recherches antérieures ont établi la corrélation entre la délétion 6q et la progression vers une maladie lymphoproliférative des lymphocytes T, identifiant le gène BACH2 comme un candidat potentiel de gènes suppresseurs de tumeur. BACH2 et PRDM1 sont des gènes décrits comme ayant un rôle fondamental dans l'oncogenèse, la différenciation et le contrôle de l'apoptose des lymphocytes B et T au cours du stress oxydatif. En outre, plusieurs études sur un modèle murin, ont suggéré que le gène BACH2 est sensible au vieillissement et jouerait un rôle dans le processus de la sénescence cellulaire. Le rôle de ces gènes dans la réponse immunitaire diminuée chez la personne âgée et dans les pathologies malignes lymphoides , n'est pas connu chez l’homme.
NOTRE HYPOTHÈSE
1. Des études récentes (y compris notre étude précédente) sur le facteur de transcription BACH2 et PRDM1 ont mis en évidence leur impact sur les régulations immunitaires. Il a été démontré notamment que le gène BACH2 est très sensible aux modifications génétiques liées au vieillissement chez les souris. Malgré l'intérêt croissant pour le rôle de BACH2, et de nombreuses études sur des modèles murins , les études sur le gène BACH2 chez l'homme sont très limitées. Ce concept nous a incité à étudier la variation de l'expression du gène BACH2 et PRDM1 en relation avec l'âge dans les principales sous-populations lymphocytaires d'individus sains.
2. L'apoptose et la sénescence sont deux types de réponses cellulaires affectées par le cancer et les processus de vieillissement mais par des mécanismes différents. La carcinogenèse est associée à une réduction progressive de la capacité des cellules à déclencher l'apoptose et la sénescence. Le processus d'apoptose des lymphocytes et les marqueurs de sénescence cellulaire ont donc été étudiés dans notre étude..
3. La leucémie lymphoïde chronique (LLC), une des maladies associée au vieillissement, est caractérisée par l'accumulation de lymphocytes B malins. Dans la leucémie lymphoïde chronique, l'anergie des cellules malignes est associée à la faible expression du PRDM1 (BLIMP1), un régulateur critique de la différenciation en cellules plasmatiques. Nous avons donc examiné l'expression de facteurs de transcription spécifiques BACH2 et PRDM1 dans les sous-populations lymphocytaires des patients porteurs de LLC et comparé les résultats avec la population saine appariée pour l'âge.
POPULATION ET MÉTHODES
Des échantillons du sang ont été prélevés chez 60 donneurs, âgés de 20 à 90 ans, et 41 patients non traités souffrant de leucémie lymphocytaire B. Des sous-types lymphocytaires (lymphocytes B CD19 +, lymphocytes T CD8+, lymphocytes T CD4+, lymphocytes T naïfs CD4+, cellules T CD4+ effectives) ont été isolés pour des analyses moléculaires ultérieures en utilisant MACS Technology (Miltenyi), avec une pureté de chaque sous-types de lymphocytes variant entre 95% et 99%. Les transcrits d'ARNm de BACH2, PRDM1, IL-4, IFNG, TP53, CDKN2A (p16INK4A), PDCD1 (PD-1) et CD274 (PD-L1) ont été quantifiés en utilisant la technique qRT-PCR. L'expression de la protéine BACH2 a été examinée par Western blot. Pour étudier l’implication du gène BACH2 dans l'apoptose, nous avons effectué un profil “Apoptose Human EpiTect ChIP qPCR Array” dont 84 gènes clés impliqués dans la mort cellulaire programmée. Les cellules apoptotiques ont été identifiées avec le kit de détection de l'apoptose annexine-V-FITC (BD Pharmingen). Pour mesurer la ß-galactosidase, nous avons utilisé le Fluorescéine-di-beta-D-galactopyranoside par cytométrie de flux comme substrat pour la beta-galactosidase (Molecular Probes).
RÉSULTATS
• Expression du BACH2 et FOXP1 dans les cellules T et B
Des cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) ont été isolées à partir du sang de donneurs sains ou de patients atteints de LLC non traitée. Les données ont montré une augmentation significative de l'expression des protéines BACH2 et FOXP1 dans les cellules B CD19 + par rapport aux sous-ensembles de cellules T chez les patients atteints de LLC.
• Répression de l’expression des gènes BACH2 et FOXP1 dans les cellules HD T et B
Nous avons évalué l’expression du BACH2 et FOXP1 dans les cellules T et B vieillissantes en réprimant les gènes BACH2 / FOXP1 à l'aide du « knock out » du gène dans des cellules T naïves et triées par FACS (avec l'utilisation des marqueurs CD45 +, CD45RA +, CD4 + et CD8 +) et dans les cellules B naïves (CD19 +, IgD +, CD27- et CD19 + CD5 +) (27) chez les jeunes (<35 ans) (n = 10) et les personnes âgées (> 60 ans) (n = 10). Nous avons actuellement réprimé le FOXP1 dans les cellules T CD4 +, les cellules T CD8 + et les cellules B CD19 + de quatre jeunes donneurs sains et de deux patients atteints de LLC. De plus, le BACH2 a été réprimé dans les cellules T et B de deux jeunes donneurs sains. La répression par FOXP1 et BACH2 a été confirmée aux niveaux de transcription et de protéine.
• Expression de PD1 et PDL1 dans les cellules T et B de patients HD et LCL
Le vieillissement est également associé à une expression accrue de plusieurs marqueurs de sénescence et d'épuisement, notamment PD1 et PDL1 (28,29). Celles-ci pourraient entraîner une activation inefficace ou nulle des cellules T après la présentation de l'antigène par les cellules présentant l'antigène, entraînant une perte de surveillance immunitaire efficace. Dans le but de comprendre l'expression des molécules inhibitrices et l'immunosénescence avec le vieillissement, nous avons analysé les transcrits PD1 et PDL1 par RT-qPCR, ainsi que leur expression protéique mesurée par cytométrie de flux dans les cellules T et B de patients jeunes ou âgés atteints de HD et de LCL. Cette analyse nous a montré que l'expression de PD1 est augmentée de façon significative dans les lymphocytes T CD4 + / CD8 + des HD plus jeunes par rapport aux plus jeunes, ainsi que dans les lymphocytes T des patients atteints de LLC, comparée aux HD correspondant à l'âge, tant au niveau de la transcription et des protéines (Figure 3A, 3B). L'expression élevée d'ARNm et de protéines de PDL1 était également fortement corrélée à un âge plus avancé dans les cellules B HD, une augmentation supplémentaire étant détectée dans les cellules B leucémiques (Figure 3A, 3B). De plus, nous avons trouvé une forte corrélation inverse entre BACH2 et PD1 dans les lymphocytes T CD4 + / CD8 +; et entre BACH2 et PDL1 dans les cellules CD19 + B.
• Signification clinique de l’expression de BACH2 / PRDM1 et de FOXP1 dans les lymphocytes B leucémiques de patients atteints de LLC
La valeur pronostique de l'expression de BACH2 / PRDM1 et FOXP1 dans des cellules CD19 + B purifiées a été analysée par RT-qPCR rétrospectivement dans une cohorte de patients atteints de LLC (n = 270) et corrélée au stade clinique et au statut de mutation du IGHV. Dans cette cohorte rétrospective de LLC, l'expression accrue de BACH2 (BACH2hi) était corrélée à une amélioration de la survie sans traitement (p = 0,0352) (Figure 4A). Au contraire, l'augmentation de l'expression de FOXP1 (FOXP1lo) était corrélée à une détérioration de la survie globale des patients LCL dans la même cohorte (p = 0,0165) (Figure 4B). Cependant, il n'y avait pas de corrélation entre le statut de mutation du stade Binet2 / FOXP1 et Binet ou IGHV. Nous n’avons observé aucune corrélation significative avec PRDM1 en termes de survie des patients atteints de LLC.
CONCLUSIONS
Dans ce travail, nous avons examiné l'expression des gènes BACH2 et PRDM1 afin d’investiguer son potentiel en tant que biomarqueur prédictif du vieillissement.
Nos données suggèrent que :
1) l'expression de l'ARNm du BACH2 et PRDM1 est associée aux modifications phénotypiques des lymphocytes en relation avec le vieillissement.
2) La sous-expression du gène BACH2, corrélée à l'âge, favoriserait l’augmentation des “exhausted T-cells”, des cellules sénescentes et de la résistance à l'apoptose cellulaire. BACH2 et PRDM1 semblent être impliqués dans la détérioration des fonctions lymphocytaires liée au vieillissement et donc du processus d'immuno-sénescence.
3) Des investigations moléculaires complémentaires sur les mutations génétiques BACH2 et PRDM1 permettront de mieux comprendre le rôle de ces gènes dans l’évolution des fonctions lymphocytaires chez l’homme âgé, son impact sur l’immuno-senescence et la prédisposition aux tumeurs malignes qui en résulte.
References:
1) Ravoet M, Sibille C, Roufosse F, Duvillier H, Sotiriou C, Schandene L, et al. 6q- is an early and persistent chromosomal aberration in CD3-CD4+ T-cell clones associated with the lymphocytic variant of hypereosinophilic syndrome. Haematologica 2005;90(6):753-65.
2) Stamatopoulos B, Meuleman N, De Bruyn C, Pieters K, Anthoine G, Mineur P, et al. A molecular score by quantitative PCR as a new prognostic tool at diagnosis for chronic lymphocytic leukemia patients. PloS one 2010;5(9) doi 10.1371/journal.pone.0012780.
3) Bron D, Ades L, Fulop T, Goede V. Aging and malignant hemopathies. Haematologica 2015;100(5):571-4 doi 10.3324/haematol.2014.117721.
4) Garaud S, Roufosse F, De Silva P, Gu-Trantien C, Lodewyckx JN, Duvillier H, et al. FOXP1 is a regulator of quiescence in healthy human CD4(+) T cells and is constitutively repressed in T cells from patients with lymphoproliferative disorders. European journal of immunology 2017;47(1):168-79 doi 10.1002/eji.201646373.
5) De Silva P, Garaud S, Solinas C, de Wind A, Van den Eyden G, Jose V, et al. FOXP1 negatively regulates tumor infiltrating lymphocyte migration in human breast cancer. EBioMedicine 2019;39:226-38 doi 10.1016/j.ebiom.2018.11.066.
6) Chi VLD, Garaud S, De Silva P, Thibaud V, Stamatopoulos B, Berehad M, et al. Age-related changes in the BACH2 and PRDM1 genes in lymphocytes from healthy donors and chronic lymphocytic leukemia patients. BMC cancer 2019;19(1):81 doi 10.1186/s12885-019-5276-2.
7) Poster presented at the Meeting AACR (Atlanta, March 29 till April 3, 2019)
8) Dang L, Sibille C, Willard-Gallo K, Bron D. Aging and Malignant Hemopathies: a Complex Multistep Process. Handbook of Immunosenescence In press;2nd Edition
Annexe 1
Le vieillissement est caractérisé par un déclin progressif de la surveillance immunitaire qui favorise le développement de la tumeur chez les patients âgés. L'un des mécanismes utilisé par les cellules malignes pour échapper à la surveillance immunitaire est la modification génétique ou épigénétique des gènes suppresseurs de tumeur. Des études sur les cellules B et nos recherches antérieures ont établi la corrélation entre la délétion 6q et la progression vers une maladie lymphoproliférative des lymphocytes T, identifiant le gène BACH2 comme un candidat potentiel de gènes suppresseurs de tumeur. BACH2 et PRDM1 sont des gènes décrits comme ayant un rôle fondamental dans l'oncogenèse, la différenciation et le contrôle de l'apoptose des lymphocytes B et T au cours du stress oxydatif. En outre, plusieurs études sur un modèle murin, ont suggéré que le gène BACH2 est sensible au vieillissement et jouerait un rôle dans le processus de la sénescence cellulaire. Le rôle de ces gènes dans la réponse immunitaire diminuée chez la personne âgée et dans les pathologies malignes lymphoides , n'est pas connu chez l’homme.
NOTRE HYPOTHÈSE
1. Des études récentes (y compris notre étude précédente) sur le facteur de transcription BACH2 et PRDM1 ont mis en évidence leur impact sur les régulations immunitaires. Il a été démontré notamment que le gène BACH2 est très sensible aux modifications génétiques liées au vieillissement chez les souris. Malgré l'intérêt croissant pour le rôle de BACH2, et de nombreuses études sur des modèles murins , les études sur le gène BACH2 chez l'homme sont très limitées. Ce concept nous a incité à étudier la variation de l'expression du gène BACH2 et PRDM1 en relation avec l'âge dans les principales sous-populations lymphocytaires d'individus sains.
2. L'apoptose et la sénescence sont deux types de réponses cellulaires affectées par le cancer et les processus de vieillissement mais par des mécanismes différents. La carcinogenèse est associée à une réduction progressive de la capacité des cellules à déclencher l'apoptose et la sénescence. Le processus d'apoptose des lymphocytes et les marqueurs de sénescence cellulaire ont donc été étudiés dans notre étude..
3. La leucémie lymphoïde chronique (LLC), une des maladies associée au vieillissement, est caractérisée par l'accumulation de lymphocytes B malins. Dans la leucémie lymphoïde chronique, l'anergie des cellules malignes est associée à la faible expression du PRDM1 (BLIMP1), un régulateur critique de la différenciation en cellules plasmatiques. Nous avons donc examiné l'expression de facteurs de transcription spécifiques BACH2 et PRDM1 dans les sous-populations lymphocytaires des patients porteurs de LLC et comparé les résultats avec la population saine appariée pour l'âge.
POPULATION ET MÉTHODES
Des échantillons du sang ont été prélevés chez 60 donneurs, âgés de 20 à 90 ans, et 41 patients non traités souffrant de leucémie lymphocytaire B. Des sous-types lymphocytaires (lymphocytes B CD19 +, lymphocytes T CD8+, lymphocytes T CD4+, lymphocytes T naïfs CD4+, cellules T CD4+ effectives) ont été isolés pour des analyses moléculaires ultérieures en utilisant MACS Technology (Miltenyi), avec une pureté de chaque sous-types de lymphocytes variant entre 95% et 99%. Les transcrits d'ARNm de BACH2, PRDM1, IL-4, IFNG, TP53, CDKN2A (p16INK4A), PDCD1 (PD-1) et CD274 (PD-L1) ont été quantifiés en utilisant la technique qRT-PCR. L'expression de la protéine BACH2 a été examinée par Western blot. Pour étudier l’implication du gène BACH2 dans l'apoptose, nous avons effectué un profil “Apoptose Human EpiTect ChIP qPCR Array” dont 84 gènes clés impliqués dans la mort cellulaire programmée. Les cellules apoptotiques ont été identifiées avec le kit de détection de l'apoptose annexine-V-FITC (BD Pharmingen). Pour mesurer la ß-galactosidase, nous avons utilisé le Fluorescéine-di-beta-D-galactopyranoside par cytométrie de flux comme substrat pour la beta-galactosidase (Molecular Probes).
RÉSULTATS
• Expression du BACH2 et FOXP1 dans les cellules T et B
Des cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) ont été isolées à partir du sang de donneurs sains ou de patients atteints de LLC non traitée. Les données ont montré une augmentation significative de l'expression des protéines BACH2 et FOXP1 dans les cellules B CD19 + par rapport aux sous-ensembles de cellules T chez les patients atteints de LLC.
• Répression de l’expression des gènes BACH2 et FOXP1 dans les cellules HD T et B
Nous avons évalué l’expression du BACH2 et FOXP1 dans les cellules T et B vieillissantes en réprimant les gènes BACH2 / FOXP1 à l'aide du « knock out » du gène dans des cellules T naïves et triées par FACS (avec l'utilisation des marqueurs CD45 +, CD45RA +, CD4 + et CD8 +) et dans les cellules B naïves (CD19 +, IgD +, CD27- et CD19 + CD5 +) (27) chez les jeunes (<35 ans) (n = 10) et les personnes âgées (> 60 ans) (n = 10). Nous avons actuellement réprimé le FOXP1 dans les cellules T CD4 +, les cellules T CD8 + et les cellules B CD19 + de quatre jeunes donneurs sains et de deux patients atteints de LLC. De plus, le BACH2 a été réprimé dans les cellules T et B de deux jeunes donneurs sains. La répression par FOXP1 et BACH2 a été confirmée aux niveaux de transcription et de protéine.
• Expression de PD1 et PDL1 dans les cellules T et B de patients HD et LCL
Le vieillissement est également associé à une expression accrue de plusieurs marqueurs de sénescence et d'épuisement, notamment PD1 et PDL1 (28,29). Celles-ci pourraient entraîner une activation inefficace ou nulle des cellules T après la présentation de l'antigène par les cellules présentant l'antigène, entraînant une perte de surveillance immunitaire efficace. Dans le but de comprendre l'expression des molécules inhibitrices et l'immunosénescence avec le vieillissement, nous avons analysé les transcrits PD1 et PDL1 par RT-qPCR, ainsi que leur expression protéique mesurée par cytométrie de flux dans les cellules T et B de patients jeunes ou âgés atteints de HD et de LCL. Cette analyse nous a montré que l'expression de PD1 est augmentée de façon significative dans les lymphocytes T CD4 + / CD8 + des HD plus jeunes par rapport aux plus jeunes, ainsi que dans les lymphocytes T des patients atteints de LLC, comparée aux HD correspondant à l'âge, tant au niveau de la transcription et des protéines (Figure 3A, 3B). L'expression élevée d'ARNm et de protéines de PDL1 était également fortement corrélée à un âge plus avancé dans les cellules B HD, une augmentation supplémentaire étant détectée dans les cellules B leucémiques (Figure 3A, 3B). De plus, nous avons trouvé une forte corrélation inverse entre BACH2 et PD1 dans les lymphocytes T CD4 + / CD8 +; et entre BACH2 et PDL1 dans les cellules CD19 + B.
• Signification clinique de l’expression de BACH2 / PRDM1 et de FOXP1 dans les lymphocytes B leucémiques de patients atteints de LLC
La valeur pronostique de l'expression de BACH2 / PRDM1 et FOXP1 dans des cellules CD19 + B purifiées a été analysée par RT-qPCR rétrospectivement dans une cohorte de patients atteints de LLC (n = 270) et corrélée au stade clinique et au statut de mutation du IGHV. Dans cette cohorte rétrospective de LLC, l'expression accrue de BACH2 (BACH2hi) était corrélée à une amélioration de la survie sans traitement (p = 0,0352) (Figure 4A). Au contraire, l'augmentation de l'expression de FOXP1 (FOXP1lo) était corrélée à une détérioration de la survie globale des patients LCL dans la même cohorte (p = 0,0165) (Figure 4B). Cependant, il n'y avait pas de corrélation entre le statut de mutation du stade Binet2 / FOXP1 et Binet ou IGHV. Nous n’avons observé aucune corrélation significative avec PRDM1 en termes de survie des patients atteints de LLC.
CONCLUSIONS
Dans ce travail, nous avons examiné l'expression des gènes BACH2 et PRDM1 afin d’investiguer son potentiel en tant que biomarqueur prédictif du vieillissement.
Nos données suggèrent que :
1) l'expression de l'ARNm du BACH2 et PRDM1 est associée aux modifications phénotypiques des lymphocytes en relation avec le vieillissement.
2) La sous-expression du gène BACH2, corrélée à l'âge, favoriserait l’augmentation des “exhausted T-cells”, des cellules sénescentes et de la résistance à l'apoptose cellulaire. BACH2 et PRDM1 semblent être impliqués dans la détérioration des fonctions lymphocytaires liée au vieillissement et donc du processus d'immuno-sénescence.
3) Des investigations moléculaires complémentaires sur les mutations génétiques BACH2 et PRDM1 permettront de mieux comprendre le rôle de ces gènes dans l’évolution des fonctions lymphocytaires chez l’homme âgé, son impact sur l’immuno-senescence et la prédisposition aux tumeurs malignes qui en résulte.
References:
1) Ravoet M, Sibille C, Roufosse F, Duvillier H, Sotiriou C, Schandene L, et al. 6q- is an early and persistent chromosomal aberration in CD3-CD4+ T-cell clones associated with the lymphocytic variant of hypereosinophilic syndrome. Haematologica 2005;90(6):753-65.
2) Stamatopoulos B, Meuleman N, De Bruyn C, Pieters K, Anthoine G, Mineur P, et al. A molecular score by quantitative PCR as a new prognostic tool at diagnosis for chronic lymphocytic leukemia patients. PloS one 2010;5(9) doi 10.1371/journal.pone.0012780.
3) Bron D, Ades L, Fulop T, Goede V. Aging and malignant hemopathies. Haematologica 2015;100(5):571-4 doi 10.3324/haematol.2014.117721.
4) Garaud S, Roufosse F, De Silva P, Gu-Trantien C, Lodewyckx JN, Duvillier H, et al. FOXP1 is a regulator of quiescence in healthy human CD4(+) T cells and is constitutively repressed in T cells from patients with lymphoproliferative disorders. European journal of immunology 2017;47(1):168-79 doi 10.1002/eji.201646373.
5) De Silva P, Garaud S, Solinas C, de Wind A, Van den Eyden G, Jose V, et al. FOXP1 negatively regulates tumor infiltrating lymphocyte migration in human breast cancer. EBioMedicine 2019;39:226-38 doi 10.1016/j.ebiom.2018.11.066.
6) Chi VLD, Garaud S, De Silva P, Thibaud V, Stamatopoulos B, Berehad M, et al. Age-related changes in the BACH2 and PRDM1 genes in lymphocytes from healthy donors and chronic lymphocytic leukemia patients. BMC cancer 2019;19(1):81 doi 10.1186/s12885-019-5276-2.
7) Poster presented at the Meeting AACR (Atlanta, March 29 till April 3, 2019)
8) Dang L, Sibille C, Willard-Gallo K, Bron D. Aging and Malignant Hemopathies: a Complex Multistep Process. Handbook of Immunosenescence In press;2nd Edition
Annexe 1
Figure 1: BACH2 and FOXP1 protein expression in the major lymphocyte subsets from CLL patients. Expression level in CD4+, CD8+ T cells and CD19+ B cells was determined by flow cytometry in CLL patients (n=21).
Figure 2: Repression of FOXP1 and BACH2 gene expression in HD T and B cells.
FOXP1 and BACH2 gene repression in CD4+ T cells, CD8+ T cells and CD19+ B cells from young HD (n=4), which were being confirmed at both transcript (RT-qPCR) and protein (western blot) level.
FOXP1 and BACH2 gene repression in CD4+ T cells, CD8+ T cells and CD19+ B cells from young HD (n=4), which were being confirmed at both transcript (RT-qPCR) and protein (western blot) level.
Figure 3: PD1 and PDL1 expression in T and B cells from HDs and CLL patients
(A) PD1 mRNA expression in CD4+ T cells, CD8+ T cells and PDL1 mRNA expression in CD19+ B cells from age-matchedHDs (n=60) and CLL patients (n=41) analysed by RT-qPCR. (B) PD1 protein expression in CD4+ T cells, CD8+ T cells and PDL1 protein expression in CD19+ B cells from age-matchedHDs (n=10) and CLL patients (n=15) evaluated by flow cytometry.
(A) PD1 mRNA expression in CD4+ T cells, CD8+ T cells and PDL1 mRNA expression in CD19+ B cells from age-matchedHDs (n=60) and CLL patients (n=41) analysed by RT-qPCR. (B) PD1 protein expression in CD4+ T cells, CD8+ T cells and PDL1 protein expression in CD19+ B cells from age-matchedHDs (n=10) and CLL patients (n=15) evaluated by flow cytometry.
Figure 4: Clinical significance of BACH2 and FOXP1 expression in leukemic B cells from CLL patients. BACH2 and FOXP1expression in purified CD19+ B cells was analysed by RT-qPCR retrospective cohort of CLL patients (n= 270) and (A) Kaplan-Meier curves for BACH2lo and BACH2hi and, (B) FOXP1lo and FOXP1hi groups determined from the whole cohort using the median value of gene expression analyzed by RT-qPCR in purified leukemic B cells form the cohort. P values <0.05 are considered as significant. OS: Overall survival and TFS: treatment-free survival.
