RESUME DES TRAVAUX DE LUAN DANG à l’Institut J. Bordet : BACH2 ET IMMUNOSENESCENCE
INTRODUCTION
Le vieillissement est caractérisé par un déclin progressif de la surveillance immunitaire qui favorise le développement de la tumeur chez les patients âgés. L'un des mécanismes utilisé par les cellules malignes pour échapper à la surveillance immunitaire est la modification génétique ou épigénétique des gènes suppresseurs de tumeur. Des études sur les cellules B et nos recherches antérieures ont établi la corrélation entre la délétion 6q et la progression vers une maladie lymphoproliférative des lymphocytes T, identifiant le gène BACH2 comme un candidat potentiel de gènes suppresseurs de tumeur. BACH2 et PRDM1 sont des gènes décrits comme ayant un rôle fondamental dans l'oncogenèse, la différenciation et le contrôle de l'apoptose des lymphocytes B et T au cours du stress oxydatif. En outre, plusieurs études sur un modèle murin, ont suggéré que le gène BACH2 est sensible au vieillissement et jouerait un rôle dans le processus de la sénescence cellulaire. Le rôle de ces gènes dans la réponse immunitaire diminuée chez la personne âgée et dans les pathologies malignes lymphoïdes n'est pas connu chez l’homme.
NOTRE HYPOTHÈSE
1. Des études récentes (y compris notre étude précédente) sur le facteur de transcription BACH2 et PRDM1 ont mis en évidence leur impact sur les régulations immunitaires. Il a été démontré notamment que le gène BACH2 est très sensible aux modifications génétiques liées au vieillissement chez les souris. Malgré l'intérêt croissant pour le rôle de BACH2, et de nombreuses études sur des modèles murins, les études sur le gène BACH2 chez l'homme sont très limitées. Ce concept nous a incité à étudier la variation de l'expression du gène BACH2 et PRDM1 en relation avec l'âge dans les principales sous-populations lymphocytaires d'individus sains.
2. L'apoptose et la sénescence sont deux types de réponses cellulaires affectées par le cancer et les processus de vieillissement mais par des mécanismes différents. La carcinogenèse est associée à une réduction progressive de la capacité des cellules à déclencher l'apoptose et la sénescence. Le processus d'apoptose des lymphocytes et les marqueurs de sénescence cellulaire ont donc été étudiés dans notre étude.
3. La leucémie lymphoïde chronique (LLC), une des maladies associée au vieillissement, est caractérisée par l'accumulation de lymphocytes B malins. Dans la leucémie lymphoïde chronique, l'anergie des cellules malignes est associée à la faible expression du PRDM1 (BLIMP1), un régulateur critique de la différenciation en cellules plasmatiques. Nous avons donc examiné l'expression de facteurs de transcription spécifiques BACH2 et PRDM1 dans les sous-populations lymphocytaires des patients porteurs de LLC et comparé les résultats avec la population saine appariée pour l'âge.
2. L'apoptose et la sénescence sont deux types de réponses cellulaires affectées par le cancer et les processus de vieillissement mais par des mécanismes différents. La carcinogenèse est associée à une réduction progressive de la capacité des cellules à déclencher l'apoptose et la sénescence. Le processus d'apoptose des lymphocytes et les marqueurs de sénescence cellulaire ont donc été étudiés dans notre étude.
3. La leucémie lymphoïde chronique (LLC), une des maladies associée au vieillissement, est caractérisée par l'accumulation de lymphocytes B malins. Dans la leucémie lymphoïde chronique, l'anergie des cellules malignes est associée à la faible expression du PRDM1 (BLIMP1), un régulateur critique de la différenciation en cellules plasmatiques. Nous avons donc examiné l'expression de facteurs de transcription spécifiques BACH2 et PRDM1 dans les sous-populations lymphocytaires des patients porteurs de LLC et comparé les résultats avec la population saine appariée pour l'âge.
POPULATION ET MÉTHODES
Des échantillons du sang ont été prélevés chez 60 donneurs, âgés de 20 à 90 ans, et 41 patients leucémies lymphocytaires B non traités. Des sous-types lymphocytaires (lymphocytes B CD19 +, lymphocytes T CD8+, lymphocytes T CD4+, lymphocytes T naïfs CD4+, cellules T CD4+ effectives) ont été isolés pour des analyses moléculaires ultérieures en utilisant MACS Technology (Miltenyi), avec une pureté de chaque sous-types de lymphocytes variant entre 95% et 99%. Les transcrits d'ARNm de BACH2, PRDM1, IL-4, IFNG, TP53, CDKN2A (p16INK4A), PDCD1 (PD-1) et CD274 (PD-L1) ont été quantifiés en utilisant la technique qRT-PCR. L'expression de la protéine BACH2 a été examinée par Western blot. Pour étudier l’implication du gène BACH2 dans l'apoptose, nous avons effectué un profil “Apoptose Human EpiTect ChIP qPCR Array” dont 84 gènes clés impliqués dans la mort cellulaire programmée. Les cellules apoptotiques ont été identifiées avec le kit de détection de l'apoptose annexine-V-FITC (BD Pharmingen). Pour mesurer la ß-galactosidase, nous avons utilisé le Fluorescéine-di-beta-D-galactopyranoside par cytométrie de flux comme substrat pour la bêta-galactosidase (Molecular Probes).
RÉSULTATS
1. L'expression des gènes BACH2 et PRDM1 est fortement corrélée à l'âge dans les principaux sous-groupes de lymphocytes du donneur sain. L'expression de l'ARNm de BACH2 diminue avec l'âge, avec des différences statistiquement significatives observées dans tous les sous-groupes lymphocytaires: CD4+, CD4+ naïf, CD4+ mémoire, lymphocytes T CD8+ et lymphocytes B CD19+ (p <0,0001; <0,0001; 0,0118; <0,0001 et 0,0004 respectivement). En parallèle, l'expression du gène PRDM1 augmente significativement avec l'âge dans les mêmes sous-populations. Les modifications phénotypiques des lymphocytes sont liées à l'expression du gène BACH2 et PRDM1. Avec la sous-expression du gène BACH2, le groupe plus âgé présente une diminution sévère du nombre et de la qualité des lymphocytes T cytotoxiques (p=0,0005 et <0,0001), alors que l’on observe une augmentation du taux de cellules T “exhausted” qui expriment fortement les PD-1 et PD-L1. L'expression du gène PCCD1 (PD-1) et CD274 (PD-L1) est inversement corrélée avec le gène BACH2 dans les mêmes sous-groupes de lymphocytes (p=0,0342; 0,0254 et 0,0429 respectivement). Notre analyse protéomique (par Western Blotting) a démontré que l’expression des protéines BACH2 dans les sous-populations de lymphocytes T et B étaient également significativement corrélée avec l'expression des transcrits.
2. La régulation négative de BACH2 liée à l'âge, est corrélée à la sénescence et la résistance à l'apoptose dans les principaux sous-groupes de lymphocytes. Nous avons, en outre, observé une corrélation entre BACH2 et les marqueurs reconnus de sénescence, tels que p16INK4A (CDKN2A) et SA-β-GAL avec la perte du CD28+ sur les lymphocytes T. La ChIP-qPCR Assay a démontré que BACH2 est lié directement à plusieurs gènes impliqués dans la mort cellulaire programmée. La réduction de l'apoptose est liée à l'âge dans les cellules T CD4+ et dans les cellules B CD19+ (p=0,03 dans les deux sous-populations). Comme récemment rapporté pour les souris déficientes en BACH2, nos données démontrent que la régulation négative de BACH2 est fortement corrélée avec une diminution de l'apoptose des lymphocytes T CD4 + et CD19 + (r = 0,57 et 0,61).
3. Les réductions d’expression de BACH2 dans l'ARNm sont également observées dans les lymphocytes CD4+ et CD8+, ainsi que dans les cellules B leucémiques provenant de patients porteurs de CLL non traités, comparées aux donneurs sains d'âge correspondant (p=0,0006; 0,0003 et 0,008 respectivement). Comme attendu, le gène PRDM1 est significativement surexprimé dans les sous-populations de cellules T CD4+ et CD8+ (p=0,003 et 0,001, respectivement) chez des patients avec CLL mais pas dans les lymphocytes B malins.
2. La régulation négative de BACH2 liée à l'âge, est corrélée à la sénescence et la résistance à l'apoptose dans les principaux sous-groupes de lymphocytes. Nous avons, en outre, observé une corrélation entre BACH2 et les marqueurs reconnus de sénescence, tels que p16INK4A (CDKN2A) et SA-β-GAL avec la perte du CD28+ sur les lymphocytes T. La ChIP-qPCR Assay a démontré que BACH2 est lié directement à plusieurs gènes impliqués dans la mort cellulaire programmée. La réduction de l'apoptose est liée à l'âge dans les cellules T CD4+ et dans les cellules B CD19+ (p=0,03 dans les deux sous-populations). Comme récemment rapporté pour les souris déficientes en BACH2, nos données démontrent que la régulation négative de BACH2 est fortement corrélée avec une diminution de l'apoptose des lymphocytes T CD4 + et CD19 + (r = 0,57 et 0,61).
3. Les réductions d’expression de BACH2 dans l'ARNm sont également observées dans les lymphocytes CD4+ et CD8+, ainsi que dans les cellules B leucémiques provenant de patients porteurs de CLL non traités, comparées aux donneurs sains d'âge correspondant (p=0,0006; 0,0003 et 0,008 respectivement). Comme attendu, le gène PRDM1 est significativement surexprimé dans les sous-populations de cellules T CD4+ et CD8+ (p=0,003 et 0,001, respectivement) chez des patients avec CLL mais pas dans les lymphocytes B malins.
CONCLUSIONS
Dans ce travail, nous avons examiné l'expression des gènes BACH2 et PRDM1 afin d’investiguer son potentiel en tant que biomarqueur prédictif du vieillissement.
Nos données suggèrent que l'expression de l'ARNm du BACH2 et PRDM1 est associée aux modifications phénotypiques des lymphocytes en relation avec le vieillissement.
La sous-expression du gène BACH2, corrélée à l'âge, favoriserait l’augmentation des “exhausted T-cells”, des cellules sénescentes et de la résistance à l'apoptose cellulaire. BACH2 et PRDM1 semblent être impliqués dans la détérioration des fonctions lymphocytaires liée au vieillissement et donc du processus d'immuno-sénescence.
Des investigations moléculaires complémentaires sur les mutations génétiques BACH2 et PRDM1 permettront de mieux comprendre le rôle de ces gènes dans l’évolution des fonctions lymphocytaires chez l’homme âgé, son impact sur l’immuno-sénescence et la prédisposition aux tumeurs malignes qui en résulte.
Nos données suggèrent que l'expression de l'ARNm du BACH2 et PRDM1 est associée aux modifications phénotypiques des lymphocytes en relation avec le vieillissement.
La sous-expression du gène BACH2, corrélée à l'âge, favoriserait l’augmentation des “exhausted T-cells”, des cellules sénescentes et de la résistance à l'apoptose cellulaire. BACH2 et PRDM1 semblent être impliqués dans la détérioration des fonctions lymphocytaires liée au vieillissement et donc du processus d'immuno-sénescence.
Des investigations moléculaires complémentaires sur les mutations génétiques BACH2 et PRDM1 permettront de mieux comprendre le rôle de ces gènes dans l’évolution des fonctions lymphocytaires chez l’homme âgé, son impact sur l’immuno-sénescence et la prédisposition aux tumeurs malignes qui en résulte.